CytoSub et cytométrie in situ : rêve ou réalité ?

jeudi 22 décembre 2005
par  Thyssen

Analyser des cellules une par une à une vitesse de plusieurs milliers par seconde et les classer en fonction de leurs paramètres de diffusion de la lumière et de leur émission de fluorescence ? Rien de tel pour faire un suivi des milieux côtiers ! Le besoin est important car cet écosystème est connu pour subir des changements drastiques induits par les variations météorologiques et accentués par les activités anthropiques. Et ces changements on un impact économique élevé, allant de la fermeture d’une plage (souvent d’après le principe de précaution plus que parce qu’il y a risque avéré, ce qui contribue à la mauvaise image balnéaire d’une région) et à l’interdiction de la vente des produits de la mer.

Actuellement, aucun système ne permet de « voir » ces changements à micro-échelle spatio-temporelle, combinant haute fréquence et qualité des informations obtenues, sans qu’il n’y ai une participation humaine compétente considérable pour prélever et analyser les échantillons, puis traiter les données.
Les problèmes rencontrés, si nous envisageons d’utiliser la cytomètrie en flux de laboratoire pour faire une surveillance directe sont variés :

- I Voir quoi ?

Il existe de nombreux indicateurs permettant d’identifier les changements environnementaux dans le milieu marin côtier (voir les directive de la CEE sur la qualité des eaux de baignades (liens), les directives OMS sur la qualité de l’eau, les programmes MEDPOL...), permettant de prendre des décisions actives quant à la gestion de ces zones. Cependant, un des indicateurs majeurs de ces variations, qui subit de plein fouet toute perturbation physique et chimique, n’est pas encore mis au point : le phytoplancton. Ces cellules microscopiques autotrophes sont à la base du système trophique et sont en même temps ultra sensibles aux concentrations en nutriments et aux paramètres hydrologiques. La grande biodiversité qui les caractérise est malheureusement un paramètre difficile à observer et à évaluer. En effet, les techniques actuelles (microscopie, analyses pigmentaires..) ne sont pas suffisamment rapides et ciblées pour obtenir une information tout aussi efficace que leur variabilité en terme d’abondance et de diversité. Actuellement, la fréquence d’échantillonnage du phytoplancton est faible (bimensuelle et hebdomadaire pendant les saisons à risques (http://www.ifremer.fr/envlit/pdf/rephypdf/REPHY0305_procedures.pdf)) et souvent se restreint, faute de main d’œuvre compétente, à des espèces clefs (potentiellement originaires d’efflorescences toxiques par exemples). Ce constat est frustrant, d’un part parce que l’on sait que cet indicateur permettrait de mettre en évidence des perturbations du milieu avant d’en subir les effets à l’échelle humaine, ensuite parce que l’on ne sait toujours pas réellement comment le phytoplancton dans sont entier réagis à telle ou telle perturbation extérieure tant que nous ne l’étudions pas à haute fréquence.

La cytometrie en flux est un outil qui pourrait partiellement subvenir à ces lacunes à condition de modifier l’instrument pour qu’il puisse répondre aux préoccupations de l’in situ.
Ainsi est apparu le CytoSense, que l’on nomme aussi CytoSub une fois mis à l’eau. Fabriqué aux Pays-Bas par une petite entreprise (www.cytobuoy.com), cet outil va être dépeint sous toutes ses coutures dans les paragraphes qui vont suivre.

1 - « Grand » volume d’eau et « grande » taille des cellules...grand problème pour la cytometrie ?

Premier problème rencontré avec les cytomètres de laboratoires : la taille des particules qui passent par la tubulure et dans la chambre de mesure.
La plupart ne peuvent analyser des cellules dépassant grosso modo 100-200 µm de largeur, qui correspond à
1- le diamètre de la chambre de mesure
2- le diamètre du faisceau laser
Les cellules de phytoplancton peuvent facilement dépasser cette largeur, et faire plusieurs mm de longueurs (voir les chaînes).
Le CytoSense a donc été conçut pour accepter les particules allant jusqu’à 800 µm de largeur et plusieurs mm de longueur.

Le phytoplancton peut être très concentré dans les cas d’efflorescences algales printanières et lors des phénomènes d’eutrophisation. Nous nous retrouvons alors avec une espèce dominante et il est assez facile de déterminer l’ensemble des assemblages phytoplanctoniques.
Mais, lorsque l’on ne se trouve pas dans ces situations (qui n’englobent pas la totalité des perturbations affectant le phytoplancton), alors le phytoplancton peut regrouper des espèces et des abondances tout aussi diverses.
Nous sommes face à une situation que la plupart des cytomètres de laboratoires ne peuvent résoudre : les événements rares.

D’où le petit plus du CytoSense :
Avaler autant de volume qu’on veut !
(En respectant bien entendu la capacité des buffers).
Pour ne pas que cela mette un temps fou, la vitesse a été augmentée (passant à 16 µl.cm-3 au lieu de 1 µl.cm-3), sans bien sur, perte d’information.

2 - Grande diversité phytoplanctonique....autre grand problème ?

Ensuite, il vient le problème de la diversité du phytoplancton. Comme vous l’avez vu dans les autres articles sur ce site web, la cytométrie apporte une approximation concernant la taille des cellules, leur structure interne et l’émission de fluorescence des pigments qu’elles possèdent. Ces informations sont ponctuelles, c’est-à-dire, chaque signal émis par la cellule lorsqu’elle intercepte le laser se résume à un pic de lumière dont on récupère soit le maximum soit l’intégration. Beaucoup de cellules on une intensité ou un contenu pigmentaire identique alors qu’elles n’appartiennent pas du tout à la même catégorie. Cela oblige le regroupement des différentes cellules phytoplanctoniques en fonction de l’intensité des différentes fluorescence ou en fonction de l’intensité des signaux de diffusion ou de diffraction. Limitant de ce fait la perception de la diversité du phytoplancton.

Le CytoSense va plus loin. Il ne permet pas bien entendu de donner le nom de l’espèce ni même la famille, mais il va donner une information bien plus qualitative des assemblages phytoplanctonique. Ceci en récupérant le signal du profil entier de chaque cellule rencontrée.
Cela donne ceci :

Par la suite, on peut différencier des groupes de ressemblances en fonction de plusieurs profils obtenus, ce qui permettra de catégoriser les types cellulaires observés et donc de créer des standards correspondant à une période donnée, ou à une perturbation donnée.

2 - Et les bactéries ?

Les bactéries in situ ? C’est possible bien entendu, à plusieurs conditions : ajouter un PMT qui permettrai de les distinguer en SWS. Placer tout un système d’incubation des bactéries avec un marqueur cellulaire (sinon on ne verra pas de fluorescence) et de récupération des déchets. Définir des protocoles d’analyses précis, sachant que les bactéries sont beaucoup plus nombreuses....
Voila, ya plus qu’à...

II
Voir où et comment

1- Les besoins de l’in situ

In situ pour certaines oreilles, veut dire groooooossses complications. L’eau et l’électronique sont deux choses qui ne vont pas souvent ensemble.
Le CytoSense possède une version immergeable qui pèse environs 80 kg. Une coque en aluminium lui permet d’atteindre des profondeurs de 200 m, limite quasi maximale ou l’on rencontre des cellules phytoplanctonique. Cette version porte alors le nom de CytoSub.

Ensuite il faut que l’appareil puisse être maniable, transportable, donc petit. Les cytomètres de petite taille commencent à poindre le jour mais il faut alors que l’ensemble des technologies soit concentrées tout en restant stables au transport, et dans notre cas à la houle.

Miniaturisation du système optique :

Le système optique utilise une autre technologie qu’une succession de filtres passe bande et de PMTs : il s’agit du HPMT (Hybrid photomultiplier) et du réseaux concave holographique (tes souhaits...)

Ce système permet de séparer les différentes longueurs d’ondes. Le HPMT, qui ressemble à un nid d’abeille, va récupérer ces longueurs d’ondes avec une résolution de 30 nm et les intensifier.

La gestion de l’information

Ensuite il faut pouvoir envoyer les commandes et recevoir l’information de la part d’un appareil qui se trouvera sous l’eau. La connection se fait via un câble RS232 et les données sont directement digitalisées par un lot de cartes d’acquisitions situées dans l’appareil.

3-
Le journal de bord... à venir


Documents joints

avec les images ça donne ça
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